51精品自偷自拍

1. Freestyle™ 293-F细胞的培养：在37℃，125rpm，8% CO2的摇床培养箱中培养；转染当天Freestyle™ 293-F细胞密度达到1.5-2.5×106个/ml时可以进行转染，但细胞存活率需>95%；可以使用生产的台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(C0011)进行细胞存活率检测。

2. 以50ml悬浮培养的Freestyle™ 293-F细胞为例，取两个洁净无菌离心管，分别加入1.25ml不含抗生素和血清的Freestyle™ 293-F51精品自偷自拍液；然后其中一管加入50μ驳质粒DNA，另一管加入100μ濒 尝颈辫辞293贵&迟谤补诲别;转染试剂，分别用移液器轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。将含有DNA的培养液用枪轻轻加入含尝颈辫辞293贵&迟谤补诲别;转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置15分钟(室温存放6小时内稳定)。

转染体系体积10ml20ml50ml100ml200ml500ml

尝颈辫辞293贵&迟谤补诲别;转染试剂20μ濒40μ濒100μ濒200μ濒400μ濒1ml

Freestyle™ 293-F51精品自偷自拍液0.25ml0.5ml1.25ml2.5ml5ml12.5ml

DNA10μ驳20μ驳50μ驳100μ驳200μ驳500μ驳

Freestyle™ 293-F51精品自偷自拍液0.25ml0.5ml1.25ml2.5ml5ml12.5ml

单独稀释好的尝颈辫辞293贵&迟谤补诲别;转染试剂和DNA，混匀并室温静止放置15分钟， 随后加入到培养的悬浮细胞中继续培养48-72小时，后续进行目的蛋白的检测和纯化。

3. 把2.5ml 尝颈辫辞293贵&迟谤补诲别;转染试剂-DNA混合物全部加入到50ml悬浮培养的Freestyle™ 293-F细胞中。由于青霉素/链霉素双抗可能影响重组蛋白的表达，通常不建议在细胞转染时加入双抗；如51精品自偷自拍环境容易发生污染，可酌情加入1/5常规用量的双抗。

4. Freestyle™ 293-F细胞在37℃，125rpm，8% CO2的摇床培养箱中继续培养48-72小时后，即可收集细胞进行目的蛋白的检测和纯化。

常见问题：

1. 转染效率低：

a. 优化质粒与尝颈辫辞293贵&迟谤补诲别;转染试剂比例，有必要是可以适当尝试加大质粒用量。

b. 应使用高纯度、无菌、无污染物的质粒进行转染，DNA纯度方面A260/A280比值要接近1.8通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能有RNA污染。可以使用生产的质粒大量抽提试剂盒(D0026)进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。

c. 需用无抗生素和无血清培养液配制尝颈辫辞293贵&迟谤补诲别;转染试剂和质粒的混合物。

d. 转染后培养时间不足，而被误认为转染效率偏低。悬浮状态下的Freestyle™ 293-F细胞转染后至显著表达所需培养时间通常为48-72小时。

e. 检查细胞是否有支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。

f. 如果没有检测到目的蛋白表达，应该仔细核对转染质粒的测序结果，确保测序结果和读码框正确。

g. 检查转染时细胞密度是否过高。

2. 细胞毒性较明显：

a. 目的基因的表达蛋白有毒性。此时可以和空载体转染效果比较，以确定是否是目的基因蛋白表达对细胞产生毒性。如果确定有细胞毒性，可以考虑适当减少质粒用量，并按照比例减少尝颈辫辞293贵&迟谤补诲别;转染试剂。

b. 检查转染时细胞密度是否太低。

c. 检查细胞是否有支原体等微生物污染。

附录：

常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、51精品自偷自拍量和推荐的培养体积等相关数据表：

Multiple Well Plates or DishesSingle Well Only for Plates

Diameter (Bottom, mm)*Growth Area (cm2)*Average Cell YieldTotal Well Volume (ml)Working Volume (ml)Recommended Volume (ml)

6 well34.89.59.5 × 10516.81.9-2.92

12 well22.13.83.8 × 1056.90.76-1.141

24 well15.61.91.9 × 1053.40.38-0.570.5

48 well11.00.959.5 × 1041.60.19-0.2850.25

96 well6.40.323.2 × 1040.360.10-0.200.1

384 well2.70.0565.6 × 1030.1120.025-0.0500.030

1536 well1.63 × 1.63**0.0252.5 × 1030.01250.005-0.0100.010

3.5 cm dish3499.0 × 105NA1.8-2.72

6 cm dish52212.1 × 106NA4.2-6.35

10 cm dish8.4555.5 × 106NA11-16.512

15cm dish141521.5 × 107NA30.4-45.635

24.5cm dish22.4 × 22.4**5005.0 × 107NA100-150120

*Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning.

**These wells or dishes are square.