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动物细胞原代培养的方法有哪些

动物细胞原代培养是直接从活体组织中分离细胞并进行shou次培养的技术，其核心是将组织块分散为单细胞或小细胞团，再模拟体内环境促进细胞生长。根据组织分散方式的不同，常用方法主要有以下 4 类：

一、酶消化法（常用）

利用蛋白酶分解组织间的胶原蛋白、弹性蛋白等连接物质，使组织分散为单细胞，适用于多数实质性组织（如肝脏、肾脏、肌肉等）。

常用酶及特点：

胰蛋白酶（Trypsin）：常用，适用于消化纤维组织少的软组织（如上皮组织），在 37℃下作用（浓度 0.25%-0.5%），pH 7.2-7.6 时活性最佳，消化后需用含血清的培养基终止反应（血清可抑制胰蛋白酶活性）。

胶原酶（颁辞濒濒补驳别苍补蝉别）：对胶原纤维分解能力强，适用于消化纤维组织丰富的组织（如结缔组织、肿瘤组织），无需血清终止，可在含血清的培养基中直接使用。

EDTA（乙二胺四乙酸）：非酶类螯合剂，通过结合钙离子破坏细胞间连接，常与胰蛋白酶混合使用（如 0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA），增强消化效果。

操作步骤：

组织剪碎成 1-2mm? 的小块，用 PBS 清洗 2-3 次去除血污；

加入适量酶溶液（覆盖组织块），37℃水浴振荡消化（时间因组织而异，通常 30 分钟至数小时）；

显微镜下观察到多数细胞分散后，加入含血清的培养基终止消化；

过滤（用 200 目筛网）去除未消化的组织块，离心（1000rpm，5 分钟）收集细胞；

用培养基重悬细胞，计数后接种到培养瓶中。

二、组织块培养法（简单易行）

无需酶消化，直接将组织块贴附于培养容器表面，利用组织块边缘细胞的迁移生长获得细胞，适用于纤维组织丰富的组织（如皮肤、肌肉、胚胎组织）或对酶敏感的细胞。

操作步骤：

组织剪碎成 0.5-1mm? 的细小块（越小越易贴壁），PBS 清洗后沥干；

在培养瓶内壁均匀摆放组织块（间距 0.5cm 左右），翻转培养瓶，加入少量培养基（仅覆盖瓶底即可）；

37℃培养箱静置 2-4 小时，待组织块贴附后，缓慢翻转培养瓶（避免组织块脱落），使培养基淹没组织块；

继续培养，约 3-7 天后可见细胞从组织块边缘迁出，形成单层时进行传代。

叁、机械分散法（适用于易碎组织）

通过物理方法（如研磨、筛网过滤）分散组织，适用于结构疏松、易于分散的组织（如脾脏、淋巴结、骨髓等），优点是操作快速，对细胞损伤小。

操作步骤：

组织放入含少量培养基的平皿中，用注射器针头或玻璃匀浆器轻轻研磨；

研磨后的细胞悬液通过筛网（100-200 目）过滤，去除杂质；

离心收集细胞，重悬后接种培养。

四、螯合剂处理法（辅助或单独使用）

除 EDTA 外，柠檬酸盐、草酸盐等螯合剂也可通过破坏细胞间钙离子依赖的连接实现组织分散，常与酶消化法联合使用，或用于对酶敏感的细胞（如上皮细胞）。

不同方法的选择原则

酶消化法：优先用于需要获得大量单细胞、且组织较致密的样本（如肝脏、肾脏）；

组织块培养法：适合纤维丰富、酶消化效果差的组织（如皮肤、肌肉），或希望保留更多细胞间相互作用的场景；

机械分散法：仅用于结构疏松的组织，避免对脆弱细胞造成机械损伤。

无论哪种方法，原代培养的核心是无菌操作和温和处理（减少对细胞的损伤），且shou次培养时细胞密度不宜过低（通常 10?-10? cells/mL），以提高存活率。